為了成功地分離樣品，必須根據樣品特性和分離目的合理地設計出分離純化實驗方案。在設計實驗方案時，應當考慮的因素主要包括凝膠過濾介質或預裝柱的選擇，洗脫劑的選擇，層析柱尺寸的控制，以及層析過程中有關參數的確定。
1、凝膠過濾介質的選擇
1.1、分離目標和凝膠過濾介質的特性
1）根據分離樣品的數量和目的，生化分離過程分為分析型和制備型分離。
2）分析型分離中樣品的量較少，分離目的包括目標分子純度測定，分子量測定，分子量分布分析，獲取微量的目標分子等。
3）制備型分離涉及樣品的量相對較多，分離目的包括對樣品進行脫鹽和緩沖液交換，去除混合物中的某些雜質，實驗室小規模的獲取目標物質，以及工業化制備某種物質等。
4）凝膠顆粒大小有粗、中、細、超細等，其顆粒直徑依次減小。一般情況下，粗規格的凝膠適合于對數量較多的樣品進行分離，中規格的凝膠適合于少量、微量樣品的制備，常規分析和測定，而細和超細規格的凝膠則適合于微量和極微量樣品的分析。
1.2、選擇性曲線和分離范圍
1）待分離物質的分子大小是決定選用何種介質的最重要因素，絕大多數情況下，所選凝膠的分級范圍應當涵蓋目標分子的大小。只有在這種情況下，介質才能對目標分子和其他大小不同的雜質分子表現出不同的選擇性（α），從而進行有效分離。
2）凝膠介質的選擇性曲線對于指導凝膠的選擇有很大幫助。選擇性曲線是凝膠的重要參考指標，一般是通過溶質的有效分配系數Kav對溶質的分子大小作圖得到。有時也可以用溶質的洗脫體積Ve對分子大小作圖。
1.3、樣品和洗脫劑的特性
1）在分子量相同的情況下，分子形狀不同的物質分配系數和洗脫體積相差很大。每種介質的選擇性曲線都有針對球狀蛋白和針對葡聚糖兩種，應根據目標分子的形狀更接近球狀蛋白還是線型的葡聚糖來確定其適合哪種選擇性曲線，進而決定介質類型。
2）在目標分子的分子量或分子形狀未知的情況下，一般可以先選擇分級范圍較寬，有著較高排阻限的介質來進行分離。
2、洗脫劑的選擇
1）凝膠過濾層析中所用流動相即洗脫劑通常不對選擇性產生影響，從理論上講，如果所分離物質不帶電荷，可以直接用蒸餾水進行洗脫，實際操作時，當對較大體積的樣品進行脫鹽實驗時，也的確有用蒸餾水洗脫的例子。然而絕大多數情況下人們考慮用緩沖液而不是蒸餾水來作為洗脫劑。
2）選擇緩沖液時首先要考慮的是在純化過程中維持合適的pH，在此pH下目標分子穩定性良好。大多數凝膠過濾在中性pH附近進行，此時建議使用緩沖能力在pH6-8的水相緩沖系統，此環境對多數生物分子及介質都是適宜的。
3）有的凝膠介質本身會帶有少量的負電荷，這會對按分子大小分離的凝膠過濾層析結果產生影響，為了排除這種影響，洗脫劑通常需要具有一定的離子強度，通常0.15mol/L的離子強度足以排除溶質與介質之間任何的離子作用。
3、層析柱的選擇
1）柱壁材料結實、化學惰性，能夠承受一定的操作壓力，在常規的層析條件下保持穩定，不與樣品及洗脫劑發生相互作用。
2）層析柱的入口和出口部分的死體積盡可能小，低于柱體積的0.1%，這樣可以使樣品的稀釋程度最小化，同時防止已經分離的樣品區帶在柱下端重新混合。
3）柱內有設計合理的凝膠床支持物，既能有效的支撐凝膠床，又不易被堵塞，保證液流能夠均勻的通過。
4）容易拆卸，方便清洗，最好配件具有通用性。
5）實驗室常用的凝膠過濾柱的內徑大多在4-16mm，而柱長大多在25-100cm。
當實驗方案設計完成后，就需要著手對選擇好的凝膠介質、層析柱、洗脫劑、樣品等進行準備，裝柱，平衡，加樣，洗脫，樣品檢測并收集，層析柱的清洗和再生。
1、凝膠的準備
1）如果介質是以已溶脹好的形式出售的，此類介質一般也無需預處理，使用前靜置使介質沉降，傾去上清液，按濕膠：洗脫劑（v/v）=3:1的比例添加洗脫劑，攪勻后即可裝柱。
2）如果介質是以固態干膠形式出售的，在使用前需要進行溶脹。溶脹是介質顆粒吸水膨脹的過程，膨脹度（得水值）與基質種類、交聯度及洗脫劑種類等有關。為了填充一根選定的層析柱需要稱取多少量的干膠是可以計算的：
?干膠用量（g）=πr2h/膨脹度（床體積ml/g干膠）
2、裝柱
2.1、填充過程
1）裝柱質量的好壞直接影響到分離效果，填充不好的層析柱會導致柱床內液體流動不均勻，造成區帶擴散，大大影響分辨率，也會對層析流速產生影響。
2）裝柱過程應避免在通風和日光直射的環境中進行，以防溫度改變造成層析柱內產生氣泡。層析柱應在支架上垂直放置。裝柱之前先用洗脫劑將層析柱底部死空間內的空氣排空。
3）將已處理好的介質放置在燒杯中，倒掉過多的液體，大致使得沉降介質：上清液（v/v）=3:1.
4）介質太稠在裝柱時容易有氣泡產生，而介質太稀則很容易在柱中形成多個界面，造成很差的填充效果。
5）將介質懸液輕微攪拌混勻，利用玻棒引流盡可能一次性將介質傾入層析柱，注意液體應沿著柱內壁流下，防止有氣泡產生。
2.2、填充質量的評估
1）裝柱完成后，在進行層析之前應當對裝柱情況進行檢查，簡單的方法是將柱子對著亮光，利用透過光檢查柱床是否規整，是否有氣泡或界面存在。
2）也可以通過對有色物質進行層析并觀察區帶情況來實現，觀察有色區帶通過凝膠床時的變化情況可以檢驗填充效果，填充良好的凝膠柱在洗脫時區帶保持均勻、平穩的向下移動。
2.3、柱的平衡
1）平衡的目的是為了確保層析柱中凝膠顆粒網孔和間隙中的液體與洗脫劑在組成、pH和離子強度等方面達到完全一致，這樣在加樣和洗脫過程中就能使待分離組分始終在所需的溶液環境中，有利于目標分子活性的保持和層析行為的穩定性。
2）人們通常采用2-3個床體積的洗脫劑通過層析柱來確保其完全達到平衡。
3、樣品和洗脫劑的準備
1）洗脫劑配制時采用的試劑應當是分析純，而所用的水應當為純水。洗脫劑配制完畢，使用前最好對其進行過濾。
2）層析前樣品如果是固體，可以將其溶于一定體積的洗脫劑中，如果樣品室液體，則可以直接加樣。為了延長介質的使用壽命和保持高的分辨率，樣品中同樣必須無顆粒狀物質存在。
3）樣品的粘度是影響上樣量和分離效果的一個重要方面。
4）如果樣品粘度過高是由于濃度造成的，用洗脫劑或水稀釋樣品可以達到降低粘度的目的。
5）如果粘度是樣品中核酸等雜質引起的，可通過添加大分子聚陽離子化合物，如聚乙酰亞胺或魚精蛋白硫酸鹽將其沉淀，或添加核酸內切酶來降低粘度，但這些物質無疑會成為額外的雜質。
6）如果樣品粘度非常高的話，也可以通過往洗脫劑中添加蔗糖或葡聚糖增加洗脫劑的粘度來補償。
4、加樣
當層析柱準備好且平衡完成，樣品和洗脫劑準備完畢后，就可以開始加樣和洗脫了。加樣過程是將一定體積的樣品添加至層析柱頂端，并使其進入凝膠柱。
4.1、加樣量的選擇
1）在進行層析時樣品的添加量主要受分辨率的限制，因為分辨率Rs與樣品體積/柱體積之比有關，樣品體積/柱體積的比值增大會導致分辨率下降。
2）對于分析型分離和難度比較大的分級分離，樣品體積/柱體積之比必須很小，此時加樣體積應為床體積的0.5-5%，更小的加樣比例并不能進一步改善分辨率。
4.2、加樣方法和注意事項
1）加樣時將一定體積的樣品溶液添加至柱床的床面，依靠重力或泵提供的壓力使樣品進入床面的過程。在加樣過程中樣品溶液應盡可能均勻添加至床面，這樣在柱床的橫截面上樣品能夠均勻進入，另外要防止液流破壞床面的平整性，否則會造成區帶形狀變差，洗脫峰變寬，從而對分辨率產生很大影響。
2）加樣的方法有多種，如果采用的是成套液相層析系統，一般都提供標準的加樣方法，如通過進樣器或注射器等，最終利用泵將樣品溶液加入柱床。
3）對于不帶有可調接頭的傳統填充柱，常見的加樣方法有排干法和液面下加樣法。
4）排干法是加樣前先將層析柱上口擰開，讓床面之上的液體靠重力作用自然排干，當床面剛好暴露時將層析柱下端閥門關閉。閥門的關閉時機必須選擇恰當，過早關閉床面上仍留有少量液體會對樣品產生稀釋作用，關閉過晚會導致床面變干。
5）用吸管將樣品輕輕鋪加到床面上，注意不能破壞床面的平整，以免造成區帶的扭曲和傾斜，然后打開柱下端閥門，受重力作用樣品溶液進入床面，當樣品剛好完全進入時關閉閥門。
6）最后用洗脫劑充滿層析柱內床面上端空間，擰緊層析柱上口，即可以用恒流泵泵入洗脫劑開始洗脫。
5、洗脫
1）當加樣完畢并且樣品進入層析柱后，應當立即用洗脫劑對樣品進行洗脫，以防樣品在層析柱中擴散。通常洗脫過程以一個恒定的流速使洗脫劑通過層析柱，而這個恒定流速由靜水壓或者泵來控制。
2）凝膠過濾層析時可采用的最大流速受到多種因素的限制，其中最為關鍵的因素是介質的強度，流速不能超出該介質的最大流速限制。
3）在分析型分離時對分辨率的要求較高，因此通常會采用相對較低的流速。
6、樣品的檢測、收集和處理
1）樣品進行層析時，各組分的分離情況，目標分子的洗脫情況等都反映在層析圖譜中，在層析圖譜中，橫坐標是時間或洗脫液體積，縱坐標是檢測器的讀數。
2）根據樣品中組分性質的不同，有多種不同的檢測器可供選擇。最常用的是紫外（UV）檢測器，可以在兩到三個固定的波長如280nm、254nm、214nm下測定洗脫液的吸光度。
3）一般來說人們需要獲得分離后的樣品，因此需要收集通過層析柱的洗脫液。
4）對于最簡單的樣品分離，可以采用手工收集的方法，觀察到層析圖譜中出現洗脫峰時開始收集，到洗脫峰結束時終止收集。
5）液相層析系統一般都配置了分部收集器來對樣品進行收集。收集的模式可以有多種，常用的是按規定的時間或洗脫液體積進行分部收集，也可根據檢測器檢測到的洗脫情況按洗脫峰進行收集。
7、凝膠過濾介質的再生、清洗和貯存
1）理論上來說，在洗脫劑具有一定離子強度的情況下，樣品中所有組分都應當在一個柱體積內被洗脫，當洗脫液體積超過一個柱體積時洗脫即可停止，但實驗中通常會使用1.5-2個柱體積的洗脫劑來完成洗脫過程。
2）在清洗方法上，最為常規的是采用堿洗，根據介質的pH穩定范圍（短程）不同，用0.1-0.5mol/L的NaOH溶液對介質進行清洗除去污染物。
3）浸泡在溶液中的層析柱和介質在很少使用的情況下容易出現微生物生長的現象，尤其是葡聚糖和瓊脂糖類型的凝膠介質，易于感染會分泌糖苷酶的微生物，導致基質聚合物中的糖苷鍵降解而破壞了介質的結構。因此，無論是層析柱還是介質，在長期不使用時，不建議浸泡在對于微生物生長來說營養豐富的緩沖液如磷酸鹽緩沖液中，另外，在其浸泡的溶液中添加適當的抑菌劑是必須的。
